Identification and Expression Analysis of GELP Gene Family in Camellia Sinensis
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摘要:
从拟南芥数据库中获得GELP基因家族注册号, 运用生物信息学分析的方法, 在茶树数据库中得到了GELP基因家族成员86个, 这些基因可分为9个亚族.其编码蛋白的氨基酸数为171~753, 理论等电点为4.35~9.48, 蛋白质分子量为18.594 19~84.550 54 kDa。基因结构分析表明, 有3条基因只有2个外显子, 其余基因外显子数3~13。对上游2 kb区域启动子顺式作用元件分析表明, 该基因家族成员对逆境胁迫应答MYB响应明显, 除CsGELP16、CsGELP24、CsGELP56、CsGELP61、CsGELP77、CsGELP80外, 其他基因均对抗寒元件识别位点MYC响应明显。转录组数据分析表明, CsGELP79、CsGELP64、CsGELP86、CsGELP4分别在Cold、PEG、NaCl、MeJA等处理下上调显著, 表明基因CsGELP79响应寒冷胁迫, CsGELP64响应干旱胁迫, CsGELP86响应高盐胁迫, CsGELP4响应抵抗病虫害。此外, CsGELP1、CsGELP12、CsGELP14、CsGELP15、CsGELP18、CsGELP32、CsGELP55在各种处理下均表现为下调, 说明这些基因在抗逆胁迫中起负调节作用。
Abstract:The Arabidopsis GELP genes were used as queries and 86 GELP gene members, which can be divided into 8 subgroups, were obtained from the tea plant. The amino acids of the encoding proteins were 171~753, the theoretical isoelectric points were 4.35~9.48, and the molecular weights were 18.594 19~84.550 54 kDa. Gene structure analysis showed that most members have 3~13 exons. Several cis-elements were identified in the promoter regions of the CsGELP genes that are important in regulating growth, development, light responses and the response to several stresses. Most members contain the MYB and MYC elements, which are in volved in responses to salt and cold-stresses. Transcriptome analysis showed that the expressions of CsGELP79, CsGELP64, CsGELP86, and CsGELP4 were enhanced in cold, PEG, NaCl, and MeJA treaments, respectively, indicating that CsGELP79 strongly responded to Cold stress, CsGELP64 strongly responded to drought stress, CsGELP86 strongly responded to high salt stress, and CsGELP4 strongly responded to disease and insect resistance. In addition, CsGELP1, CsGELP12, CsGELP14, CsGELP15, CsGELP18, CsGELP32, CsGELP55 were all down-regulated under various treatments, suggesting that these genes play a negative regulatory role in stress responses.
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Keywords:
- tea tree /
- GELP gene family /
- stress /
- bioinformatics analysis
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开放科学（资源服务）标志码（OSID）：
0. 引言
基因不是唯一的，而是属于多基因家族[1-2]。这些家族产生于基因、染色体片段和全基因组水平的重复[3]。植物基因家族的研究对于开发研究基因组进化的工具和阐明基因功能具有重要意义。
植物在受到干旱、寒冷、高盐、高温和氧化胁迫等外界各种非生物逆境胁迫时，会进化出一套应对逆境的保护机制以确保植物正常生长发育。在不利的环境下，植物可以通过启动相关基因表达以及改变某些蛋白结构等来保护体内正常的新陈代谢反应，从而维持植物体结构与功能的完整性[4-5]。在植物逆境信号转导过程中, Ca2+作为第二信使起着至关重要的作用[6]。脂肪酶是一种水解酶，能催化甘油三酸酯、甘油二酸酯的裂解，释放出脂肪酸和醇类[7]。GELP酯酶/脂肪酶蛋白是脂质酶的一个非常大的亚科，已在微生物和许多植物中被发现，但只有少数被鉴定为在生长、发育和应激反应中发挥作用。GELP脂肪酶-SGNH水解酶以Seri-Gly-Asn-His为4个保守残基块Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅴ，分别有一个灵活的活性部位[8]。因此，GELP酯酶和脂酶具有广泛的底物特异性，区域特异性和选择性等多功能特性。
基于水杨酸和病原菌对GELP-脂肪酶基因的诱导，提出了GELP-脂肪酶基因参与植物防御的观点[9-11]，并证明它们的活性可调节疾病易感性。同样，GELP-脂肪酶被证明是由各种非生物激发因子诱导的[12-13]，它们能够提高植物对盐和其他环境胁迫的耐受性。此外，GELP-脂肪酶被认为参与了与生长过程相关的激素途径。也有证据表明GELP-脂肪酶的表达与其他发育过程相关[14]。最后，GELP-脂肪酶参与角质层和蜡的代谢也变得越来越明显，这些物质形成了植物地上部分表皮分泌的角质层[15]。
花粉壁保护花粉粒，并在介导花粉粒与柱头的早期接触，从而促进花粉黏附柱头，促进水合中起关键作用。花粉壁由绒毡层细胞合成的富含脂质的化合物组成。GRP17是分离到的第一个花粉壁蛋白，它是花粉落在柱头后快速水合所必需的蛋白。除了含oleosin结构域的蛋白外，花粉壁蛋白主要由GELP脂肪酶/细胞外脂肪酶(EXLs)组成。拟南芥有6个EXL蛋白(EXL 1~6)，它们在基因组中聚集在一起，都属于GELPs亚家族。其中EXL4和EXL6富集于花粉壁中。EXL4是拟南芥花粉有效水合的必需基因，该基因功能缺失突变导致花粉水合延迟。EXL6的功能和作用尚不清楚，尽管已知该基因是参与拟南芥花粉发育的关键AMS的靶基因[16]。
许多GELP脂肪酶成员在植物中具有重要的功能[17]。从水稻、拟南芥和玉米等植物中分离，测序和鉴定了几种GELP酯酶/脂肪酶。Enod8是在苜蓿和模型豆科植物中发现的GELP型酯酶/脂肪酶基因，具有乙酰和丁基酯酶活性，但不具有脂肪族酯酶活性[18]。在油菜中，发现一种芥子碱酯酶具有长链脂肪族酯类的芥子碱酯酶活性[19]。从向日葵发芽后种子中分离纯化了具有脂肪乙酰化酶活性的GELP酶，从大豆叶片、马铃薯中分离纯化了几种具有非特异性乙酰化酶活性的GELP酶[20]。
本实验运用生物信息学分析的方法，在茶树数据库中进行GELP基因家族检索，对所得到的茶树GELP基因家族进行分析，初步探索该基因在茶树逆境胁迫中的表达特点和响应机制，为其功能验证和育种工作提供参考。
1. 方法
1.1 茶树GELP基因家族成员鉴定
对拟南芥(Arabidopsis thaliana)数据库(http://www.arabidopsis.org/)中的105个GELP基因保守序列蛋白，在茶树(Camellia sinensis)数据(http://tpia.teaplant.org/index.html)中经同源基因比对获得茶树GELP基因组成员信息，为避免重复对获得的所有序列进行DNAMAN比对筛选。对在茶树基因库获取已知序列的基因号、氨基酸数、等电点、分子量大小等理化性质数据进行分析(https://web.expasy.org/protparam/)。
1.2 茶树GELP基因家族进化关系
利用MEGA7和Clustalx.exe分析蛋白系统进化关系。
1.3 茶树GELP基因家族基因结构系列分析
利用GSDS(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)进行基因结构分析。
1.4 茶树GELP基因家族motif分析
利用MEME(http://meme-suite.org/tools/meme)进行motif分析。
1.5 茶树GELP家族启动子顺式作用元件分析
利用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)进行启动子顺式作用元件分析。
1.6 茶树GELP家族不同处理下的基因表达热图分析
在茶树网站(http://tpia.teaplant.org/index.html)下载4种处理下的基因表达数据，然后通过RStudio软件对数据进行处理。
2. 结果与分析
2.1 茶树GELP家族蛋白氨基酸理化性质分析
经茶树数据库同源比对得到了86条茶树GELP家族基因，命名为CsGELP1~CsGELP86(表 1)。这些基因的片段大小各不相同，编码的氨基酸在171~753之间，其中CsGELP69编码氨基酸最小，CsGELP1编码氨基酸最大。同一亚族不同基因编码氨基酸数差异不大，如CsGELP7、CsGELP8均属于家族中的I~d亚族。推测的分子量都为41.977 21 kDa。理论等电点(pI)为5.66。
表 1 茶树GELP理化性质Table 1. Physicochemical properties of Camellia sinensis GELP genes蛋白Protein 基因号 氨基酸数 分子量/kDa pI CsGELP1 TEA019805 753 84.550 54 6.29 CsGELP2 TEA009538 350 39.265 87 5.09 CsGELP3 TEA033403 477 52.341 71 6.23 CsGELP4 TEA014944 420 46.30 189 5.29 CsGELP5 TEA021609 318 34.790 15 4.86 CsGELP6 TEA017693 391 43.250 46 6.20 CsGELP7 TEA011925 381 41.977 21 5.66 CsGELP8 TEA011949 381 41.977 21 5.66 CsGELP9 TEA002483 364 39.558 08 5.76 CsGELP10 TEA022242 427 47.441 76 9.48 CsGELP11 TEA017290 173 19.332 21 8.93 CsGELP12 TEA025026 381 42.698 57 5.26 CsGELP13 TEA013181 395 44.026 56 9.09 CsGELP14 TEA031906 529 58.184 99 9.01 CsGELP15 TEA023119 441 49.433 46 9.31 CsGELP16 TEA014945 372 41.589 73 6.88 CsGELP17 TEA006158 372 41.589 73 6.88 CsGELP18 TEA021927 333 36.478 87 6.04 CsGELP19 TEA016526 432 47.343 71 8.79 CsGELP20 TEA030441 418 46.202 31 9.45 CsGELP21 TEA023896 408 44.639 03 5.90 CsGELP22 TEA031642 398 43.752 82 9.29 CsGELP23 TEA005684 404 45.138 37 4.89 CsGELP24 TEA016768 396 44.494 28 8.28 CsGELP25 TEA018131 251 27.175 57 4.51 CsGELP26 TEA027607 356 38.907 49 6.11 CsGELP27 TEA024184 398 43.672 19 7.59 CsGELP28 TEA021925 319 35.160 26 6.43 CsGELP29 TEA017694 380 41.455 36 6.09 CsGELP30 TEA000758 280 31.548 88 9.06 CsGELP31 TEA024268 388 42.807 42 8.63 CsGELP32 TEA009539 350 39.438 27 5.12 CsGELP33 TEA002692 422 46.571 56 8.76 CsGELP34 TEA029699 406 43.648 41 8.83 CsGELP35 TEA000201 374 40.922 70 7.48 CsGELP36 TEA018109 400 44.067 01 5.51 CsGELP37 TEA016109 375 41.164 32 8.64 CsGELP38 TEA032710 375 41.164 32 8.64 CsGELP39 TEA006290 415 45.491 42 6.59 CsGELP40 TEA020196 317 35.878 80 6.17 CsGELP41 TEA029024 493 52.784 76 5.06 CsGELP42 TEA013198 382 42.049 75 6.75 CsGELP43 TEA001204 368 40.960 28 8.60 CsGELP44 TEA032953 361 40.002 96 9.08 CsGELP45 TEA025484 383 42.788 46 6.30 CsGELP46 TEA022245 349 38.898 35 9.13 CsGELP47 TEA017585 411 44.914 52 6.31 CsGELP48 TEA021906 229 24.860 82 8.77 CsGELP49 TEA002792 230 25.338 02 8.59 CsGELP50 TEA030431 371 41.044 06 7.56 CsGELP51 TEA002891 380 41.085 17 8.96 CsGELP52 TEA006214 304 34.744 12 9.35 CsGELP53 TEA018148 485 53.427 83 7.87 CsGELP54 TEA030414 421 46.404 34 6.35 CsGELP55 TEA010883 541 59.702 32 7.90 CsGELP56 TEA017473 231 25.166 73 4.73 CsGELP57 TEA029864 412 46.042 12 8.85 CsGELP58 TEA028349 364 39.578 11 5.97 CsGELP59 TEA005525 354 38.458 97 8.78 CsGELP60 TEA019108 419 46.575 55 8.68 CsGELP61 TEA032960 361 39.880 59 8.36 CsGELP62 TEA028095 273 30.415 54 5.09 CsGELP63 TEA028133 269 30.456 40 9.00 CsGELP64 TEA030418 377 41.46055 6.81 CsGELP65 TEA009224 388 42.352 96 6.07 CsGELP66 TEA033119 256 28.817 88 5.60 CsGELP67 TEA011930 439 48.863 80 7.19 CsGELP68 TEA008203 363 39.383 01 8.04 CsGELP69 TEA031415 171 18.594 19 7.57 CsGELP70 TEA008402 371 40.331 68 5.06 CsGELP71 TEA024266 291 31.690 18 5.05 CsGELP72 TEA003785 416 45.376 88 4.35 CsGELP73 TEA002158 368 40.417 21 6.59 CsGELP74 TEA009528 394 43.571 92 8.28 CsGELP75 TEA000508 273 30.638 68 5.15 CsGELP76 TEA019124 480 52.363 49 5.51 CsGELP77 TEA018069 366 39.962 52 8.06 CsGELP78 TEA002455 369 40.859 99 6.40 CsGELP79 TEA016514 291 31.705 34 4.89 CsGELP80 TEA006722 225 24.921 19 5.75 CsGELP81 TEA011570 368 40.168 15 6.00 CsGELP82 TEA021936 392 43.187 14 8.00 CsGELP83 TEA021558 315 34.244 31 6.64 CsGELP84 TEA007149 328 36.048 23 8.06 CsGELP85 TEA019807 405 45.364 70 9.47 CsGELP86 TEA024286 302 33.154 58 5.55 2.2 茶树与拟南芥GELP家族多序列比对进化分析
在茶树系统进化树构建中，茶树CsGELP基因家族被划分为4个亚支(图 1)，第Ⅰ和第Ⅱ可进一步细分为6个亚支(Ⅰ中3个，Ⅱ中3个)。
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图 1 茶树(Cs), 拟南芥(At)GELP基因进化树Figure 1. Camellia sinensis (Cs), Arabidopsis thaliana(At) GELP genes evolutionary tree考虑到同源基因通常具有相同的功能，为了进一步了解茶树家族谱系及功能特点，对拟南芥和茶树GELP家族基因(AtGELP, CsGELP)使用MEGA7软件，ClustalW比对和Neighbor-joining的方法构建系统发育树。共有191个基因，其中CsGELP基因有86个、AtGELP基因105个，利用MEGA7中的NJ方法构建了系统发育树，由图可知茶树和拟南芥的GELP基因可分为四个分支(Ⅰ~Ⅳ)(图 1)，第Ⅰ、第Ⅱ和第Ⅳ分支分别由4个、3个和3个分支组成，第Ⅲ分支由2个分支组成。之前对陆生植物GELP基因的分析显示有三个主要分支和一个次要分支，这与我们的结果一致。Ⅰa亚族中包含12个拟南芥、2个茶树基因；Ⅰb里只包含6个拟南芥基因；Ⅰc中包含3个拟南芥基因和5个茶树基因；Ⅰd中有15个拟南芥基因、11个茶树基因；Ⅱa中有2个拟南芥基因、6个茶树基因；Ⅱb中有4个拟南芥基因、1个茶树基因；Ⅱc中有24个拟南芥基因、18个茶树基因；Ⅲa有4个拟南芥基因、1个茶树基因；Ⅲb中8个拟南芥基因、3个茶树基因；Ⅳa有4个拟南芥基因、4个茶树基因；Ⅳb有10个拟南芥基因、27个茶树基因；Ⅳc有14个拟南芥基因、8个茶树基因。茶树与拟南芥的GELP基因有较高的同源性，推测直系同源基因之间具有相同的功能。拟南芥的AtGELP39~44属于Ⅰa和Ⅰb亚族，可能参与授粉与受精，因此推测这两个亚族中的CsGELP56和CsGELP26也有此功能。
2.3 茶树GELP家族基因结构分析
从图 2可以看出，CsGELP52整条基因均为外显子，且CsGELP52在Ⅳb亚族，Ⅳb亚族内CsGELP52不含有内含子，而且这些亚族基因中只有CsGELP52存在内含子缺失现象。该基因家族的外显子数目都分布在1~13之间。
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图 2 茶树GELP基因外显子-内含子结构分析Figure 2. Exon intron structure analysis of Camellia sinensis GELP genes2.4 茶树GELP家族motif序列分析
在茶树GELP家族中共找到了10个motif(图 3)。除CsGELP75、CsGELP40和CsGELP30外，其他亚族内motif分布的相对比较均匀，尤其在Ⅳc亚族中CsGELP16和CsGELP17；Ⅳb亚族组中CsGELP7和CsGELP8分布的数量和位置都基本相同，具有高度的保守性，推测在同一亚族内其结构域和功能单位均相似。motif1在所有成员上分布的数量最多，且不同基因的分布情况与其他成员相比差异明显。
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图 3 茶树GELP家族motif1~motif10分析Figure 3. Camellia sinensis GELP family motif1 ~ motif10 analysis2.5 茶树GELP家族基因上游2 kb顺式作用元件分析
为了确定茶树GELP基因家族启动子上游2 kb的顺式作用区域，在该基因的起始密码子上游搜索2 kb碱基序列进行分析(表 2)，86条茶树GELP基因中大部分基因均含有逆境胁迫应答元件MYB和抗寒元件识别位点MYC(图 4)；除CsGELP5、CsGELP7、CsGELP11、CsGELP15、CsGELP16、CsGELP17、CsGELP22、CsGELP24、CsGELP28、CsGELP31、CsGELP33、CsGELP49、CsGELP50、CsGELP52、CsGELP65、CsGELP66、CsGELP73、CsGELP86外，其他基因均含有乙烯应答元件ERE；CsGELP58含有脱落酸元件ABRE最多，推测该基因在ABA胁迫应答机制中起关键作用；CsGELP4、CsGELP7、CsGELP9、CsGELP15、CsGELP16、CsGELP17、CsGELP18、CsGELP20、CsGELP21、CsGELP23、CsGELP25、CsGELP27、CsGELP28、CsGELP29、CsGELP31、CsGELP33、CsGELP37、CsGELP38、CsGELP40、CsGELP42、CsGELP44、CsGELP45、CsGELP47、CsGELP48、CsGELP50、CsGELP52、CsGELP53、CsGELP54、CsGELP58、CsGELP59、CsGELP62、CsGELP63、CsGELP66、CsGELP70、CsGELP72、CsGELP75、CsGELP76、CsGELP77、CsGELP80、CsGELP84、CsGELP85这41个基因均含有响应MYB结合位点诱导干旱的作用元件MBS; CsGELP1、CsGELP24、CsGELP52、CsGELP63、CsGELP72、CsGELP79、CsGELP84这7条基因均含有DRE元件，启动子作用元件决定了该基因对逆境信号的胁迫机制。
表 2 茶树GELP上游2 kb顺式作用元件分布Table 2. Camellia sinensis GELP upstream 2 kb cis element distribution基因 乙烯应答元件ERE 脱水应答元件DRE 脱落酸应答元件ABRE 逆境胁迫应答元件MYB 抗寒元件识别位点MYC MYB结合位点诱导干旱MBS CsGELP1 5 1 5 3 5 0 CsGELP2 5 0 0 2 2 0 CsGELP3 3 0 2 3 3 0 CsGELP4 2 0 0 3 6 2 CsGELP5 0 0 2 3 9 0 CsGELP6 4 0 0 4 4 0 CsGELP7 0 0 0 2 7 1 CsGELP8 2 0 4 4 2 0 CsGELP9 5 0 2 3 3 2 CsGELP10 1 0 0 5 5 0 CsGELP11 0 0 4 3 3 0 CsGELP12 2 0 0 6 2 0 CsGELP13 1 0 0 2 5 0 CsGELP14 3 0 2 2 2 0 CsGELP15 0 0 1 6 3 2 CsGELP16 0 0 6 0 0 2 CsGELP17 0 0 0 0 1 1 CsGELP18 4 0 2 2 6 1 CsGELP19 5 0 0 0 1 0 CsGELP20 1 0 0 5 4 1 CsGELP21 2 0 0 4 9 1 CsGELP22 0 0 1 3 9 0 CsGELP23 2 0 0 4 2 2 CsGELP24 0 1 0 1 0 0 CsGELP25 2 0 0 2 3 2 CsGELP26 2 0 0 4 5 0 CsGELP27 1 0 2 2 4 1 CsGELP28 0 0 3 6 8 1 CsGELP29 2 0 0 4 5 1 CsGELP30 3 0 0 1 4 0 CsGELP31 0 0 4 3 2 2 CsGELP32 2 0 2 1 2 0 CsGELP33 0 0 3 6 6 2 CsGELP34 2 0 2 2 4 0 CsGELP35 5 0 0 5 3 0 CsGELP36 4 0 1 0 5 0 CsGELP37 1 0 3 2 5 1 CsGELP38 1 0 0 2 6 1 CsGELP39 2 0 1 44 3 0 CsGELP40 1 0 1 7 2 3 CsGELP41 3 0 0 5 2 0 CsGELP42 2 0 3 1 4 3 CsGELP43 6 0 7 7 3 0 CsGELP44 3 0 2 0 5 1 CsGELP45 3 0 1 3 3 1 CsGELP46 1 0 1 5 5 0 CsGELP47 3 0 1 2 6 1 CsGELP48 2 0 2 4 5 1 CsGELP49 0 0 3 4 7 0 CsGELP50 0 0 0 2 4 1 CsGELP51 5 0 0 4 5 0 CsGELP52 0 1 0 2 7 3 CsGELP53 1 0 6 6 9 2 CsGELP54 2 0 1 3 1 1 CsGELP55 3 0 3 3 3 0 CsGELP56 5 0 1 3 0 0 CsGELP57 2 0 1 3 4 0 CsGELP58 3 0 9 2 10 1 CsGELP59 1 0 3 1 5 3 CsGELP60 2 0 0 4 4 0 CsGELP61 3 0 2 6 0 0 CsGELP62 1 0 1 4 7 2 CsGELP63 1 1 7 6 2 1 CsGELP64 1 0 1 4 4 0 CsGELP65 0 0 2 5 3 0 CsGELP66 0 0 5 1 4 2 CsGELP67 3 0 0 2 3 0 CsGELP68 3 0 1 4 5 0 CsGELP69 4 0 1 5 2 0 CsGELP70 1 0 6 3 1 1 CsGELP71 3 0 0 4 2 0 CsGELP72 1 1 1 2 5 1 CsGELP73 0 0 0 3 6 0 CsGELP74 1 0 0 2 2 0 CsGELP75 1 0 4 2 1 1 CsGELP76 1 0 0 1 3 2 CsGELP77 1 0 3 5 0 2 CsGELP78 6 0 2 1 7 0 CsGELP79 3 1 0 3 2 0 CsGELP80 1 0 1 4 0 1 CsGELP81 1 0 2 3 3 0 CsGELP82 4 0 1 3 3 0 CsGELP83 1 0 0 2 1 0 CsGELP84 3 1 0 0 3 1 CsGELP85 1 0 0 7 7 4 CsGELP86 0 0 1 1 1 0 2.6 茶树GELP家族基因热图分析
在寒冷处理下(图 5)，第7天时CsGELP76、CsGELP25、CsGELP2、CsGELP35、CsGELP36、CsGELP43等基因均上调表达，相对表达量均在对照的1.5倍以上，其中CsGELP25在同组对比处理中均表现下调，推测该基因可能在植物处于寒冷环境胁迫情况下起负调节作用。
在NaCl处理下(图 5)，CsGELP85的表达量显著上调，是对照的3.6倍，CsGELP44、CsGELP13、CsGELP85、CsGELP1这4个基因表现出不同程度的上调，其余基因都表显出不同程度的下调，推测这些下调基因在茶树抗高盐胁迫中起负调节作用。
在PEG处理下(图 5)，CsGELP44、CsGELP25、CsGELP51均上调表达，相对表达量均在对照的2.6倍以上，其中CsGELP44最高，是对照的12.45倍，推测CsGELP44在植物干旱胁迫中起正向调节作用。
在MeJA处理下(图 5)，CsGELP1、CsGELP55、CsGELP33、CsGELP77、CsGELP71、CsGELP66、CsGELP76、CsGELP57、CsGELP86、CsGELP15、CsGELP38、CsGELP27、CsGELP85、CsGELP41、CsGELP65、CsGELP68、CsGELP44、CsGELP52、CsGELP26均表现为显著下调，据此推测这19个基因可能与茶树抵抗病虫害有关，并且起负调节作用。而CsGELP39、CsGELP5、CsGELP32、CsGELP48、CsGELP53、CsGELP78、CsGELP63、CsGELP4、CsGELP31、CsGELP74、CsGELP22、CsGELP40、CsGELP56这13个基因起正向调节作用，推测这些基因对茶树抵抗病虫害起正调节作用。
CsGELP1、CsGELP12、CsGELP14、CsGELP15、CsGELP18、CsGELP32、CsGELP55这些基因对所有处理相对表达量均表现出下调，推测这些基因可能在植物逆境胁迫中起负调节作用。
3. 结论
聚类分析结果表明，茶树GELP蛋白可分为4个大分支亚族Ⅰ~Ⅳ，CsGELP36、CsGELP68、CsGELP83、CsGELP22、CsGELP71与拟南芥GELP同源性较高，说明这些基因在亲缘关系方面较为接近。
在茶树中根据基因结构中内含子分布情况可知：GELP基因家族中存在部分基因中无内含子或者内含子数少于3个，CsGELP52基因中不含内含子，因此为内含子缺失类；Ⅳb亚族中的大部分基因以及其他亚族内的基因为内含子富集类。
motif分析结果表明，除Ⅳa亚族的CsGELP75和CsGELP40外，其他亚族内motif分布的相对比较均匀，CsGELP43和CsGELP36、CsGELP16和CsGELP17、CsGELP7和CsGELP8、CsGELP45和CsGELP46分布的数量和位置都基本相同，具有高度的保守性，我们推测在同一亚族内其结构域和功能单位大致相似。
茶树GELP基因中大部分含有MYB转录因子和MYC应答元件，并且多数基因中含有与ABA响应相关的作用元件，说明GELP 基因与不同逆境胁迫和植物激素应答机制密切相关，并在其中行使不同的功能。
现已有研究表明GELP基因在植物逆境胁迫中具有重要的作用。本研究中茶树GELP基因家族成员在寒冷、NaCl、PEG、茉莉酮酸激素的诱导下，其表达量均出现不同程度的变化，其中CsGELP1、CsGELP12、CsGELP14、CsGELP15、CsGELP18、CsGELP32、CsGELP55等基因均表达下调，表明这些基因可能在植物抗寒冷、干旱、高盐和病虫害途径中起负调节作用，前期研究表明，Ca2+作为第二信使参与植物多种逆境胁迫的调控机制。本试验中，PEG处理下CsGELP44表达量显著上调，推测CsGELP44参与植物抗干旱胁迫并在其中起关键作用，是否为Ca2+介导信号通路的关键基因有待进一步验证。GELP家族基因在茶树抗逆境胁迫中起着重要的作用，为后续该基因在功能和作用机制上的研究奠定了基础以及通过基因手段改良茶树提供了理论依据。
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图 1 茶树(Cs), 拟南芥(At)GELP基因进化树
Figure 1. Camellia sinensis (Cs), Arabidopsis thaliana(At) GELP genes evolutionary tree
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图 2 茶树GELP基因外显子-内含子结构分析
Figure 2. Exon intron structure analysis of Camellia sinensis GELP genes
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图 3 茶树GELP家族motif1~motif10分析
Figure 3. Camellia sinensis GELP family motif1 ~ motif10 analysis
表 1 茶树GELP理化性质
Table 1 Physicochemical properties of Camellia sinensis GELP genes
蛋白Protein 基因号 氨基酸数 分子量/kDa pI CsGELP1 TEA019805 753 84.550 54 6.29 CsGELP2 TEA009538 350 39.265 87 5.09 CsGELP3 TEA033403 477 52.341 71 6.23 CsGELP4 TEA014944 420 46.30 189 5.29 CsGELP5 TEA021609 318 34.790 15 4.86 CsGELP6 TEA017693 391 43.250 46 6.20 CsGELP7 TEA011925 381 41.977 21 5.66 CsGELP8 TEA011949 381 41.977 21 5.66 CsGELP9 TEA002483 364 39.558 08 5.76 CsGELP10 TEA022242 427 47.441 76 9.48 CsGELP11 TEA017290 173 19.332 21 8.93 CsGELP12 TEA025026 381 42.698 57 5.26 CsGELP13 TEA013181 395 44.026 56 9.09 CsGELP14 TEA031906 529 58.184 99 9.01 CsGELP15 TEA023119 441 49.433 46 9.31 CsGELP16 TEA014945 372 41.589 73 6.88 CsGELP17 TEA006158 372 41.589 73 6.88 CsGELP18 TEA021927 333 36.478 87 6.04 CsGELP19 TEA016526 432 47.343 71 8.79 CsGELP20 TEA030441 418 46.202 31 9.45 CsGELP21 TEA023896 408 44.639 03 5.90 CsGELP22 TEA031642 398 43.752 82 9.29 CsGELP23 TEA005684 404 45.138 37 4.89 CsGELP24 TEA016768 396 44.494 28 8.28 CsGELP25 TEA018131 251 27.175 57 4.51 CsGELP26 TEA027607 356 38.907 49 6.11 CsGELP27 TEA024184 398 43.672 19 7.59 CsGELP28 TEA021925 319 35.160 26 6.43 CsGELP29 TEA017694 380 41.455 36 6.09 CsGELP30 TEA000758 280 31.548 88 9.06 CsGELP31 TEA024268 388 42.807 42 8.63 CsGELP32 TEA009539 350 39.438 27 5.12 CsGELP33 TEA002692 422 46.571 56 8.76 CsGELP34 TEA029699 406 43.648 41 8.83 CsGELP35 TEA000201 374 40.922 70 7.48 CsGELP36 TEA018109 400 44.067 01 5.51 CsGELP37 TEA016109 375 41.164 32 8.64 CsGELP38 TEA032710 375 41.164 32 8.64 CsGELP39 TEA006290 415 45.491 42 6.59 CsGELP40 TEA020196 317 35.878 80 6.17 CsGELP41 TEA029024 493 52.784 76 5.06 CsGELP42 TEA013198 382 42.049 75 6.75 CsGELP43 TEA001204 368 40.960 28 8.60 CsGELP44 TEA032953 361 40.002 96 9.08 CsGELP45 TEA025484 383 42.788 46 6.30 CsGELP46 TEA022245 349 38.898 35 9.13 CsGELP47 TEA017585 411 44.914 52 6.31 CsGELP48 TEA021906 229 24.860 82 8.77 CsGELP49 TEA002792 230 25.338 02 8.59 CsGELP50 TEA030431 371 41.044 06 7.56 CsGELP51 TEA002891 380 41.085 17 8.96 CsGELP52 TEA006214 304 34.744 12 9.35 CsGELP53 TEA018148 485 53.427 83 7.87 CsGELP54 TEA030414 421 46.404 34 6.35 CsGELP55 TEA010883 541 59.702 32 7.90 CsGELP56 TEA017473 231 25.166 73 4.73 CsGELP57 TEA029864 412 46.042 12 8.85 CsGELP58 TEA028349 364 39.578 11 5.97 CsGELP59 TEA005525 354 38.458 97 8.78 CsGELP60 TEA019108 419 46.575 55 8.68 CsGELP61 TEA032960 361 39.880 59 8.36 CsGELP62 TEA028095 273 30.415 54 5.09 CsGELP63 TEA028133 269 30.456 40 9.00 CsGELP64 TEA030418 377 41.46055 6.81 CsGELP65 TEA009224 388 42.352 96 6.07 CsGELP66 TEA033119 256 28.817 88 5.60 CsGELP67 TEA011930 439 48.863 80 7.19 CsGELP68 TEA008203 363 39.383 01 8.04 CsGELP69 TEA031415 171 18.594 19 7.57 CsGELP70 TEA008402 371 40.331 68 5.06 CsGELP71 TEA024266 291 31.690 18 5.05 CsGELP72 TEA003785 416 45.376 88 4.35 CsGELP73 TEA002158 368 40.417 21 6.59 CsGELP74 TEA009528 394 43.571 92 8.28 CsGELP75 TEA000508 273 30.638 68 5.15 CsGELP76 TEA019124 480 52.363 49 5.51 CsGELP77 TEA018069 366 39.962 52 8.06 CsGELP78 TEA002455 369 40.859 99 6.40 CsGELP79 TEA016514 291 31.705 34 4.89 CsGELP80 TEA006722 225 24.921 19 5.75 CsGELP81 TEA011570 368 40.168 15 6.00 CsGELP82 TEA021936 392 43.187 14 8.00 CsGELP83 TEA021558 315 34.244 31 6.64 CsGELP84 TEA007149 328 36.048 23 8.06 CsGELP85 TEA019807 405 45.364 70 9.47 CsGELP86 TEA024286 302 33.154 58 5.55 
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表 2 茶树GELP上游2 kb顺式作用元件分布
Table 2 Camellia sinensis GELP upstream 2 kb cis element distribution
基因 乙烯应答元件ERE 脱水应答元件DRE 脱落酸应答元件ABRE 逆境胁迫应答元件MYB 抗寒元件识别位点MYC MYB结合位点诱导干旱MBS CsGELP1 5 1 5 3 5 0 CsGELP2 5 0 0 2 2 0 CsGELP3 3 0 2 3 3 0 CsGELP4 2 0 0 3 6 2 CsGELP5 0 0 2 3 9 0 CsGELP6 4 0 0 4 4 0 CsGELP7 0 0 0 2 7 1 CsGELP8 2 0 4 4 2 0 CsGELP9 5 0 2 3 3 2 CsGELP10 1 0 0 5 5 0 CsGELP11 0 0 4 3 3 0 CsGELP12 2 0 0 6 2 0 CsGELP13 1 0 0 2 5 0 CsGELP14 3 0 2 2 2 0 CsGELP15 0 0 1 6 3 2 CsGELP16 0 0 6 0 0 2 CsGELP17 0 0 0 0 1 1 CsGELP18 4 0 2 2 6 1 CsGELP19 5 0 0 0 1 0 CsGELP20 1 0 0 5 4 1 CsGELP21 2 0 0 4 9 1 CsGELP22 0 0 1 3 9 0 CsGELP23 2 0 0 4 2 2 CsGELP24 0 1 0 1 0 0 CsGELP25 2 0 0 2 3 2 CsGELP26 2 0 0 4 5 0 CsGELP27 1 0 2 2 4 1 CsGELP28 0 0 3 6 8 1 CsGELP29 2 0 0 4 5 1 CsGELP30 3 0 0 1 4 0 CsGELP31 0 0 4 3 2 2 CsGELP32 2 0 2 1 2 0 CsGELP33 0 0 3 6 6 2 CsGELP34 2 0 2 2 4 0 CsGELP35 5 0 0 5 3 0 CsGELP36 4 0 1 0 5 0 CsGELP37 1 0 3 2 5 1 CsGELP38 1 0 0 2 6 1 CsGELP39 2 0 1 44 3 0 CsGELP40 1 0 1 7 2 3 CsGELP41 3 0 0 5 2 0 CsGELP42 2 0 3 1 4 3 CsGELP43 6 0 7 7 3 0 CsGELP44 3 0 2 0 5 1 CsGELP45 3 0 1 3 3 1 CsGELP46 1 0 1 5 5 0 CsGELP47 3 0 1 2 6 1 CsGELP48 2 0 2 4 5 1 CsGELP49 0 0 3 4 7 0 CsGELP50 0 0 0 2 4 1 CsGELP51 5 0 0 4 5 0 CsGELP52 0 1 0 2 7 3 CsGELP53 1 0 6 6 9 2 CsGELP54 2 0 1 3 1 1 CsGELP55 3 0 3 3 3 0 CsGELP56 5 0 1 3 0 0 CsGELP57 2 0 1 3 4 0 CsGELP58 3 0 9 2 10 1 CsGELP59 1 0 3 1 5 3 CsGELP60 2 0 0 4 4 0 CsGELP61 3 0 2 6 0 0 CsGELP62 1 0 1 4 7 2 CsGELP63 1 1 7 6 2 1 CsGELP64 1 0 1 4 4 0 CsGELP65 0 0 2 5 3 0 CsGELP66 0 0 5 1 4 2 CsGELP67 3 0 0 2 3 0 CsGELP68 3 0 1 4 5 0 CsGELP69 4 0 1 5 2 0 CsGELP70 1 0 6 3 1 1 CsGELP71 3 0 0 4 2 0 CsGELP72 1 1 1 2 5 1 CsGELP73 0 0 0 3 6 0 CsGELP74 1 0 0 2 2 0 CsGELP75 1 0 4 2 1 1 CsGELP76 1 0 0 1 3 2 CsGELP77 1 0 3 5 0 2 CsGELP78 6 0 2 1 7 0 CsGELP79 3 1 0 3 2 0 CsGELP80 1 0 1 4 0 1 CsGELP81 1 0 2 3 3 0 CsGELP82 4 0 1 3 3 0 CsGELP83 1 0 0 2 1 0 CsGELP84 3 1 0 0 3 1 CsGELP85 1 0 0 7 7 4 CsGELP86 0 0 1 1 1 0
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期刊类型引用(1)
1. 曹丹，刘艳丽，马林龙，李娟，金孝芳. 茶树3个TPT基因的鉴定与表达. 西南农业学报. 2023(09): 1852-1858 . 
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